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         获得高质量的RNA是进行很多分子实验（RT-qPCR，二代测序转录组分析，芯片分析，数字PCR，northem分析及cDNA文库构建等）的第一步，往往也是最关键的一步，本文针对常见的四种分离方式做一个简单的对比分析。

第一种：有机试剂萃取法
有机试剂萃取法被认为是RNA制备中的金标准。在纯化过程中，样品在含有C6H5OH的溶液中进行了均质化，然后加入CHCl3，充分混合后静置片刻然后离心。在离心过程中，样品会分为三层：下部的有机相，中层含有变性蛋白质及gDNA，而上层水相则含有RNA。然后将上层水相分离出来并先后通过异丙醇，乙醇沉淀及再溶解来获得RNA。

有机试剂萃取法优点：
1、可以快读变性核酸酶并稳定RNA；
2、成本低；
有机试剂萃取法缺点：
1、有机试剂氯化物的使用及产生的废弃物；
2、费力的手动处理流程；
3、难以自动化操作。

第二种：离心柱法
基于滤膜的离心柱法使用了底部安置有膜（通常为玻璃纤维，硅衍生物或者离子交换膜）的离心柱。使用含Rnase抑制剂（通常为胍盐）的缓冲液来裂解样品，然后利用离心力使裂解物通过膜来让核酸结合在膜上，随后使用清洗缓冲液来清洗膜然后丢弃缓冲液。接下来使用恰当的洗脱缓冲液通过离心的方式将样品洗脱下来并收集到管中。

离心柱法优点：
1、方便，容易使用；
2、可进行单一样品和96孔板样品处理；
3、可以自动化操作；
4、可以制造多种规格的膜。
离心柱法缺点：
1、易被微粒物阻塞；
2、大分子核酸如gDNA的残留；
3、制造规格决定了结合能力；
4、自动化处理时，需要复杂的真空抽提系统或离心系统。

第三种：磁珠法
磁珠法所采用的小颗粒（0.5~1 µm)具有一个顺磁的核心，其外壳经过修饰可以和特定目标分子结合。磁珠在磁场中时会随着磁场而移动，但在移除磁场后几乎不保留磁力。这使得这些磁珠基于它们表面的修饰可以与感兴趣的分子相互作用，然后通过外源磁场快速地对它们进行收集，之后移除磁场并对磁珠进行重悬。对样品首先使用含Rnase抑制剂的溶液进行裂解，然后与磁珠结合。再通过施加磁场将磁珠及其上结合的分子一起收集起来。通过数轮的释放，重悬于清洗溶液中，然后重新捕获的过程，最终将RNA释放到洗脱溶液中并移除磁珠。

磁珠法优点：
1、没有滤膜堵塞的风险；
2、基于溶液的结合动力学可以增强目标捕获的效率；
3、磁性形式使得可以进行样品的快速收集/浓缩；
4、更易在仪器平台处理；
5、可以自动化操作；
6、可用于表面修饰的化学基团丰富。
磁珠法缺点：
1、洗脱样品中可能残留磁珠颗粒
2、磁珠在粘性溶液中移动缓慢
3、手动操作时磁珠的捕获/释放操作很费力

第四种：直接裂解发
直接裂解法进行样品制备（非纯化）时采用的裂解缓冲液，可以破碎样品，稳定核酸，同时与下游应用相兼容。通常，样品与裂解试剂混合在一起，在特定条件下孵育一段时间，然后直接用于下游分析。如有必要，可以对稳定后的裂解五进行纯化而得到样品。通过免去与固体表面的结合及洗脱步骤，直接裂解法可以避免在其他纯化方法中可能会发生的偏差及对回收效率的影响。

直接裂解法优点：
1、非常快速简单；
2、最有可能准确反应样品中的RNA真实情况；
3、可以很好地应用于非常小量的样品；
4、可以进行简单的自动化操作。
5、可扩展性
直接裂解法的缺点：
1、不能用于传统的分析方法，例如通过分光光度法测定产量；
2、明显的稀释作用（对于浓缩样品更有效）；
3、为了取得好的效果，往往需要根据下游应用进行优化；
4、若没有正确处理裂解物可能残留RNase活性。

       培养基( culture medium)是人工配制的，适合微生物生长、分离鉴别的营养基础。一般基础培养基中古有蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉、氯化钠、琼脂等基本营养物质。微生物培养基应用范围很广。例如，无菌试验培养基可检查药品、生物制品是否污染细菌，它直接关系到人民用药安全；在临床及食品卫生检验中常用选择、鉴别培养基，此类培养基中根据用途不同，需要加入抑菌剂、指示剂、血液、糖等试剂，以利于特定细菌的分离与鉴别，需要使细菌大量生长、繁殖的各类培养基；病毒培养及疫苗中则需用组织细胞培养液，主要成分为多种氨基酸、核苷酸、无机盐、生长因子等。

 微生物培养基操作步骤：

1、准确称量试剂：根据不同的菌类和用途，选择适宜的培养基，培养基所需试剂必须纯净。

2、校正pH值：将称量好的培养基各种成分放入容器内，标记划线，加热溶解，补充水分，测定酸碱度，常用pH6.8～8.0的精密试纸或酸度计测定。用1NNaOH和1N HCl调节pH值到适宜范围内。

3、过滤：将玻璃漏斗置铁架上，再用纱布夹棉花或用滤纸放在漏斗中，将上述培养基倒入其中过滤至透明。

4、分装：将过滤后的培养基分装于中试管或三角瓶内(试管内每支装5mL;三角瓶中装100～150ml)，塞好棉塞用牛皮纸包扎好，准备灭菌。

5、灭菌：培养基的灭菌，常用高压蒸汽灭菌法。一般微生物的营养细胞在水中煮沸后即被杀死，但细菌的芽胞有较强的抗热性，须经高压蒸汽灭菌才能达到*灭菌的目的。根据蒸汽温度随压力升高而上升的原理，即压力越大，蒸汽温度就越高。因此，在同一温度条件下，采用高压蒸汽灭菌比干热灭菌法效果要好。而且在湿热情况下，菌体吸收水分后，其蛋白质易于凝固变性，因为蒸汽的穿透力强，杀菌效果好。

微生物培养基注意事项：

1、根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基。

2、注意各种营养物质的浓度及合适配比，保持合适渗透压。

3、将培养基的 pH 控制在适宜的范围之内，以利于不同类型微生物的生长繁殖或代谢产物的积累。

4、要注意各种原料的配比，每种培养基的配比合适的配比，可以按照老师的要求去做。

5、如需要加热的时候注意时间的把握。