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发布日期:2024/4/30 10:02:00

        PCR( Polymerase Chain Reaction)-聚合酶链式反应,可以选择性扩增一段DNA序列。其基本步骤是,首先将待扩增的模板DNA变性使之成为单链,DNA样品中,特异性的引物能够与其互补的序列杂交,在dNTPs和Taq酶存在时,就可以合成模板DNA的互补链,反应完成后,将反应混合物加热使DNA双链变性,温度下降后,过量的引物又可以开始第二轮的合成反应。这种延伸-变性-退火-延伸的循环可以重复多次,使所需要的DNA片段得到特异性的扩增。PCR反应中的主要由引物、 4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)、Mg 2+、模板和Taq DNA聚合酶五个成份组成。各个组份都能影响 PCR 结果的好坏。

1.  引物
PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则:
(1) 引物长度约为16-30 bp, 太短会降低退火温度影响引物与模板配对,从而使非特异性增高。太长则比较浪费,且难以合成。
(2)引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm=4(G+C)+2(A+T)。
(3)四种碱基应随机分布,在3'端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。
(4)引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应, 以减少由于密码子摆动产生的不配对。
(5)在引物内, 尤其在3'端应不存在二级结构。
(6)两引物之间尤其在3'端不能互补, 以防出现引物二聚体, 减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。
(7)引物5'端对扩增特异性影响不大, 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖 体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素等。通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。
(8)引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构, 以免产生非特异性扩增,影响产量。
(9)简并引物应选用简并程度低的密码子, 例如选用只有一种密码子的Met, 3'端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。
(10)一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0 μmol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体, 过低则降低产量。利用紫外分光光度计, 可精确计算引物浓度, 在1cm光程比色杯中,260nm下,引物浓度可按下式计算:
X mol/L= OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)
X: 引物摩尔浓度,A、C、G、T:引物中4种不同碱基个数。

2.  4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)
(1)dNTP应用NaOH 将pH调至7.0,并用分光光度计测定其准确浓度。
(2)dNTP原液可配成5-10 mmol/L并分装,-20℃贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200 μmol/L。
(3)理论上4 种 dNTP各20 μmol/L,足以在100 μl反应中合成2.6 μg的DNA。当dNTP终浓度大于50 mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性。4种dNTP的浓度应该相等,以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。

3.  Mg2+
(1)Mg 2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大,它可影响酶的活性和真实性,影响引物退火和解链温度, 影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。
(2)通常Mg 2+ 浓度范围为0.5-2 mmol/L.对于一种新的PCR反应,可以用0.1-5 mmol/L的递增浓度的Mg 2+ 进行预备实验,选出最适的Mg 2+浓度。
(3)在PCR反应混合物中, 应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团, 例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg 2+ 离子浓度的物质,以保证最适Mg 2+ 浓度。

4.  模板
(1)PCR反应必须以DNA为模板进行扩增, 模板DNA可以是单链分子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好)。
(2)就模板DNA而言,影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度.一般反应中的模板数量为102 -105 个拷贝,对于单拷贝基因,这需要0.1μg的人基因组DNA,10ng的酵母DNA,1ng的大肠杆菌DNA.扩增多拷贝序列时,用量更少。
(3)灵敏的PCR可从一个细胞,一根头发,一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列。
(4)模板量过多则可能增加非特异性产物。DNA中的杂质也会影响PCR的效率。

5.  Taq DNA聚合酶
一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5℃ 130 min,95℃ 40 min, 97℃ 5 min。现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶,这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间。
Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃下,30 min,掺入10 nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。Taq DNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率,一般PCR中出错率为2×10-4 核苷酸/每轮循环,在利用PCR克隆和进行序列分析时尤应注意.在100 μl PCR反应中,1.5-2单位的Taq DNA聚合酶就足以进行30轮循环。
所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减.酶量过多会使产物非特异性增加,过少则使产量降低。
反应结束后,如果需要利用这些产物进行下一步实验,需要预先灭活Taq DNA聚合酶, 灭活Taq DNA聚合酶的方法有:
(1)PCR产物经酚: 抽提,乙醇沉淀。
(2)加入10 mmol/L的EDTA螯合Mg 2+ 。
(3) 99-100℃加热10 min。目前已有直接纯化PCR产物的Kit可用。

6.  反应缓冲液
(1)反应缓冲液一般含10-50 mmol/L Tris·Cl (20℃下pH8.3-8.8), 50 mmol/L KCl和适当浓度的Mg 2+ 。Tris·Cl在20℃时pH为8.3-8.8,但在实际PCR反应中,pH为6.8-7.8. 50 mmol/L的KCl有利于引物的退火。
(2)反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100 μg/ml的牛血清白蛋白(BSA),它们可稳定酶活性,另外加入T4噬菌体的基因32蛋白则对扩增较长的DNA片段有利。
(3)各种Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。

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