聚合酶链式反应 (PCR)是分子生物学领域功能强大的技术之一。实时荧光定量PCR 是在标准 PCR 技术基础上演变而成，常用于定量样本中的 DNA 或RNA。利用荧光探针或荧光 DNA 结合染料，采用实时荧光定量PCR 仪检测荧光并完成 PCR 反应所需的热循环，实现扩增产物的定量。实时荧光定量 PCR 分析的部分实施需要经过优化以确保所有反应参数均设置精确，从而获得准确的结果。
通用原则：
1. 先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近于探针；
2. 扩增子的长度应不超过400bp，理想的最好能在100－150bp内，扩增片断越短，有效的扩增反应就越容易获得，较短的扩增片断也容易保证分析的一致性；
3. 保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，及在SG分析中非特异信号；
4. 为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连续的G）；5. 将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。
探针设计指导：
1. 在设计引物之前设计探针；
2. 探针的Tm值应在68－70℃之间，如果是目测探针，则要仔细审查GC富含区；
3. 探针的5’端要避免有鸟氨酸，5’G会有淬灭作用，即使被切割下来这种淬灭作用也还会存在；
4. 选择C多于G的链作探针，G的含量多于C会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。
5. 探针应尽可能的短，不要超过30个bp。
6. 检测探针的DNA折叠和二级结构。
引物设计指导：
1. 引物的Tm值应在58－60℃之间，这非常重要，因为我们的试验一般都使用退火温度为60℃，在这个温度下，5’核酸外切酶的活性最高。
2. 引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。
3. 将引物尽量接近于探针。循环参数当引物和探针按照上述原则设计好后，循环的参数也就确定了，当经过起始的变性温度后(根据Tag酶要求设定)，反应要经过95℃，15－20秒，60℃，60秒，对于一些模板，45秒也足够了，数据在退火时检测。
