酶联免疫吸附实验（ELISA）是一种广泛应用于生物医学研究中的定性或定量检测方法，它借助抗体的特异性识别功能来锁定并测量目标分子。类似于其他的免疫分析技术，ELISA既能够利用单克隆抗体和多克隆抗体，以实现对多种分析物（包括肽、蛋白质、抗体以及小分子）的精准检测。
在这个过程中，抗体的特异性是至关重要的，它确保了只有目标分析物才会被识别并结合。为了增强检测信号的强度和可见性，一部分抗体会与特定的酶（如常用的辣根过氧化物酶[HRP]）进行直接或间接的偶联。这种偶联使得检测方法更为灵敏，同时还能够实现信号的放大，从而提高了检测的准确性和可靠性。
ELISA技术的灵活性还体现在其可以根据不同的实验需求和预期目标，通过多种方法以及检测化学成分的调整，来定制适合的检测方案。这使得科研能够针对单个样品进行精细的检测分析，或者在大规模筛选应用中实现高通量的样本处理。无论是基础科学研究还是临床应用开发，ELISA都展现出了其作为一种强大而可靠的检测工具的潜力。
一、直接ELISA
直接ELISA是一种实验技术，其中抗原直接结合在微孔板表面，并通过直接偶联的抗体进行检测。该方法简化了实验步骤，通过以下步骤展开：
实验步骤:
步骤一：抗原固定化：将抗原直接固定在微孔板上，作为实验的第一步。
步骤二：添加封闭试剂：引入封闭试剂，以防止检测抗体出现非特异性结合。
步骤三：添加直接偶联的检测抗体：将直接偶联某种酶（如HRP）的检测抗体加入。这种抗体将结合抗原，而多余的抗体将通过洗涤被移除。
步骤四：添加酶底物：引入酶底物，在短时间内孵育后，通过读板机测定每个孔的信号。
直接法优缺点:
1、优点:
1）、快速，仅使用一种抗体，步骤相对较少。
2）、消除了第二抗体的交叉反应性。
2、缺点:
1）、一抗的免疫反应性可能受到酶或标签标记的不利影响。
2）、为每个特定的ELISA系统标记一抗，费时且昂贵。
3）、由于标记的抗体密度较低，导致较低的灵敏度。
4）、抗原的固定化不是特异性的，可能引起较高的背景干扰。
二、间接ELISA
间接ELISA与直接ELISA类似，但主要区别在于引入了第二偶联抗体来检测结合抗体。实验步骤仍然从抗原固定开始，通过添加一种封闭试剂防止结合抗体的非特异性结合。
实验步骤：
步骤一：抗原固定化：将抗原固定在微孔板上，是实验的第一步。
步骤二：添加封闭试剂：防止结合抗体的非特异性结合，维护实验的特异性。
步骤三：添加抗原特异性结合抗体：加入能够与目标抗原结合的抗体，并经短暂孵育后，通过洗涤去除多余试剂。
间接检测：引入第二抗体来检测第一结合抗体。这种抗体通常与某种酶偶联。在酶底物的作用下，短暂孵育后，使用读板机测定每个孔的信号。
间接法优缺点：
1、优点：
1）、可以在一个物种中制备多个一抗，并且使用相同的标记二抗进行检测。
2）、保留了第一抗体的最大免疫反应性。
3）、高标记的二抗密度可实现高灵敏度，导致信号放大。
2、缺点：
1）、二抗可能发生交叉反应，导致非特异性信号。
2）、过程中需要额外的孵育步骤，增加实验时间。
三、夹心ELISA
夹心ELISA是一种实验技术，其中抗原成为两种抗体之间的"三明治"中心。该方法在以下步骤中展开：
实验步骤:
步骤一：捕获抗体吸附：将第一抗体吸附在微孔板孔中，形成夹心结构。
步骤二：洗涤和封闭：在洗涤和封闭后，添加含有待检测抗原的样品。
步骤三：结合第二抗体：第二抗体结合样品中抗原的另一位点。通常，第二抗体是与某种酶偶联的抗体，用于后续检测。
步骤四：添加酶底物：在洗涤板孔之后，引入酶底物，短时间内孵育后，通过读板机测定每个孔的信号。
夹心法优缺点:
1、优点:
高特异性，使用的捕获抗体和检测抗体都具有检测特异性。
适用于复杂样品，抗原不需要进行纯化即可用于检测。
灵活性更大，灵敏度更高，可采用直接法也可采用间接法。
2、缺点:
检测物需要拥有两个以上不同的抗原表位或多个相同的重复表位。
价格较贵，耗时较多。
四、竞争ELISA
竞争性/抑制性ELISA，又被称为封闭ELISA，是一种用于定量分析物数量的方法，通过对预计信号的干扰程度进行测定。在这种实验中，一种对靶标有特异性的抗体被固定在平板上。靶标可以与某种酶结合，并用于检测。如果实验中包含的检测靶标量次于最大量，那么高浓度的未标记靶标将竞争性地结合，从而减弱信号。这种竞争性实验可用于测定某种特异性分析物的水平。
竞争法优缺点:
1、优点:
1）、高灵敏度和灵活性；
2）、能够测定微量的分析物。
2、缺点:
1）、特异性较低；
2）、需要酶标记的抗原。
