染色是生物显微玻片标本制作中最重要的环节之一。先把破坏细胞膜的选择透过性，再使用染色剂，将生物组织浸入染色剂内，使组织细胞的某一部分染上与其他部分不同的颜色或深度不同的颜色，产生不同的折射率，以便观察。
另外，银染法也较常用。当组织块浸入硝酸银溶液中时，有的组织结构能直接把硝酸银还原，使银粒附于其上，呈棕黑色或棕黄色。有些结构本身对硝酸银无直接还原能力，若加入还原剂，可使硝酸银还原沉淀显色。
常用的细胞染色方法：
1、简单染色法，常用碱性染料如美蓝等进行简单染色；
2、革兰氏染色法，主要包括结晶紫初染、碘液媒染、乙醇(或丙酮)脱色以及番红复染四个过程；
3、瑞氏染色法，瑞氏染料溶剂主要是由伊红美蓝组成；
4、吉姆萨染色法，吉姆萨染色原理与结果和瑞特染色法基本相同；
5、细胞免疫荧光染色法，免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合。
实验常用的细胞染色操作：
1、消化收集细胞，以2-10×103 cell/coverslip 接种细胞于24孔板中，滴加细胞悬液50-100µl，2小时后补加10%FBS+DMEM500µl
2、37℃细胞培养箱中培养48小时后，显微镜下观察，取细胞状态和细胞数量适应的玻片做染色。
3、去掉旧培养液，用冰冷的PBS洗两次，加3.7-4%甲醛0.5ml(in PBS)室温固定10min
4、PBS洗两次，加穿膜液0.5ml(0.1%triton X-100+0.1M Gycine)冰上30min
5、PBS洗两次，加5mg/ml BSA 0.3ml室温封闭1小时。
6、PBS洗两次，取一张封口膜，做好标记，加一抗(用5mg/ml BSA稀释1：50-100)25µl于封口膜上，将盖玻片细胞面朝下反扣在一抗液滴上，放在湿盒中室温孵育1-3小时，将盖玻片从封口膜上小心夹起，细胞面朝上放入原来的24孔板中，PBS洗两次，取另外一张封口膜，做好标记，加二抗(羊抗兔罗丹明，用5mg/ml BSA稀释1：50-100）25µl于封口膜上，将盖玻片细胞面朝下反扣在一{二}抗液滴上，放在湿盒中室温黑暗中孵育1-3小时
7、同上PBS洗两次，同上操作，将玻片与10µl DAPI （1µg/ml in PBS，贮存液：1mg/ml in dd H2O）室温孵育1-5min.
8、PBS 洗三次，将玻片背面的水分擦干，封片于载玻片上，做好标记（时间，细胞名称，实验内容，号码）
9、待封片胶干后可在荧光显微镜下观察，观察时注意记录每张玻片的内容以免混淆，观察完后将玻片放-20℃保存。
10、若只观察转染了EYFP的荧光蛋白，不需要给内源蛋白染色，可直接用DAPI染核后封片。
11、以BSA (5mg/ml)代替一抗，二抗照加为染色的对照组，做法同上。为了保证实验有重复性，每次做平行2组以上。
细胞染色注意事项：
1、细胞染色部位
细胞表面染色
胞内抗原染色
同时标记胞膜和胞内抗原
单色标记
多色标记
2、细胞表面标记
表面抗原也可能表达于细胞内
染色细胞表面标记的细胞一定是活的未标记细胞
亲细胞抗体的存在，使染色复杂。可用洗涤白细胞的方法，或在不含离子的缓冲液中37C孵育1小时，可有效去除亲细胞抗体
Fc受体，可以加外源性免疫球蛋白阻断或采用同型对照
3、细胞内标记
对细胞打孔，使单抗可以进入细胞内，同时又不破坏细胞结构的完整性
一般来说，进行胞内抗原染色时不能同时检测细胞的活性，除非用EMA标记
检测某一抗原是否表达，以及对抗原进行表达定位时，检测同一标本的胞膜和胞浆抗原要分开进行。
对于某些核酸染料（如DAPI、TO、AO等）为活胞染料，无需固定或透膜
4、同时检测胞膜和胞内抗原
对表面标志、胞内抗原、DNA含量可任意组合同时分析 。
染色步骤是：细胞表面标志--固定--细胞打孔--胞内抗原--DNA含量 。
需要认识到的是，用于固定和打孔试剂的多重影响，有些条件适合某一参数而对别的参数可能非常不合适。
每一步荧光染料的选择与抗体的选择一样重要。对细胞表面标记来说，一种荧光染料一定不能被随后的打孔方法或试剂所影响。对胞内抗原检测来讲，荧光素分子要足够小，可以穿透打孔后的细胞。
5、单色标记
间接标记时，可选择单色标记
6、多色标记
考虑荧光信号之间的干扰。
细胞补偿、微球补偿
一些联合使用的抗体会彼此阻碍与各自抗原的结合，比如通过空间位阻。因此，抗体组合使用前要与单色抗体标记的结果做比较。
