预先将抗原包被再固相载体上，并加入酶标记的特异性抗体，实验时，加入待检抗原（或抗体）。如果待检物是抗原，则待检抗原于预先包被再固相载体上的抗原竞争结合酶标抗体；如果待检测物是抗体，则待检抗体就与系统中原有的酶标抗体竞争结合包被再固相载体上的抗原，通过洗涤洗掉被竞争结合的酶标抗体，最后加底物显色。需要注意的是显色结果与待检抗原（或抗体）的量成反比。
在竞争法ELISA中，阴性孔呈色深于阳性孔。阴性呈色的强度取决于反应中酶结合物的浓度和加入竞争抑制物的量，一般调节阴性对照的吸光度在1.0-1.5之间，此时反应最为敏感。
竞争法ELISA不易用自视判断结果，因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差异，一般均用比色计测定，读出S、P和N的吸光值。计算方法主要也有两种，即阳性判定值法和抑制率法。
1. 阳性判定值法
与间接法和夹心法中的阳性判定值法基本相同，ELISA试剂盒但在计算公式中引入阳性对照A值，现举某种检测抗HBc的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照为不含抗HBc的复钙人血浆，阳性对照中抗HBc含量为125±100u/ml。每次试验设2个阳性对照和3个阴性对照。
测得A值后，先计算阴性对照A值的平均值（NCX）和阳性对照A值的平均数（PCX），两个平均数的差（N-P）必须大于一个特定的数值（例如0.300）,试验才有效。3个阴性对照A值均应小于2.000，而且应≥0.5×NCX并≤1.5×NCX，如其中之一超出此范围，则弃去，而以另2个阴性对照重新计算×NCX；如有2个阴性对照A超出以上范围，则该次实验无效。阳性判定值按下式计算：阴性判定值=0.4×NCX+0.6×PCX，标本A值≤阳性判定值的反应为阳性，A＞阳性判定值的反应为阴性。
2. 抑制率法
抑制率表示标本在竞争结合中标本对阴性反应显色的抑制程度，按下式计算：
抑制率（%）= ELISA试剂盒（阴性对照A值-标本A值）×100%/阴性对照A值，一般规定抑制率≥50%为阳性，＜50%为阴性。
