您好,欢迎来到派瑞曼-上海博湖生物科技有限公司商城!
021-5776 3112
发布日期:2024/8/12 11:27:00

        PCR(聚合酶链式反应)是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链,低温(经常是60°C左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合,再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72°C左右),DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备,能在变性温度,复性温度,延伸温度之间很好地进行控制。

PCR反应的特异性决定因素:

1、引物与模板DNA特异正确的结合;

2、碱基配对原则;

3、Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性;

4、靶基因的特异性与保守性。

其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性,使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行,结合的特异性大大增加,被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区,其特异性程度就更高。


PCR 反应特异性提高的方法:  

1. 引物的设计

  引物最好在模板 cDNA 的保守区设计,长度 15-30bp,GC 含量小于 60%,3’端不超过连续三个 G 或 C,碱基分布错落有致,避免引物自身形成二聚体,设计完成之后,需进行 BLAST 检测,如果与其他基因不具有互补性,则可以进行下一步实验。

2. 降落 PCR

  降落 PCR 是一种简单的降低非特异性产物的 PCR,最大的优点就是可以降低实验耗时,同时又可以优化实验的步骤。引物的设计决定退火温度,退火温度过高会使 PCR 效率过低,过低则会使非特异扩增过多。这虽然可以通过反复尝试来优化,但费时费力。降落 PCR 提供了一个较为简易的优化方法。首先在较高的温度下扩增,此时虽然扩增效率低,但非特异扩增基本没有。随着退火温度的降低,非特异扩增会逐步增多。但由于此时特异的扩增产物已经达到一定的数量优势,因此会对非特异扩增产生强烈的竞争抑制,从而大幅提高 PCR 的特异性和效率。

3. 热启动扩增

  采用热启动方法进行扩增,是除了设计最佳引物之外,提高 PCR 反应特异性好的方式。在一般的 PCR 反应中,试剂的配置需在冰上进行,且要将 PCR 仪预热,这种方法就类似于热启动,能够一定程度的抑制错配。但是酶在低温下也存在活性,只要体系中有 DNA 链存在,就会扩增产生非特异性条带。采用热启动的方法就是在达到变性温度之前wan全抑制酶的活性,而zui有效的方法就是使用热启动 Taq 酶(或热启动高保真聚合酶)去扩增,它的原理就是采用化学修饰的方法封闭酶的活性中心,当温度上升到 95℃时恢复活性,指导扩增。

4. 巢式 PCR

  采用巢式 PCR 进行扩增,在多轮扩增结果中提高扩增特异性和灵敏度。与普通 PCR 不同的是,它采用两对引物进行扩增,首先用第一对引物普通 PCR,然后将第一轮扩增的产物稀释 100 倍后用第二对引物(巢式引物)二次扩增。因此采用巢式 PCR 可以大大增加困难模板扩增的特异性和有限靶序列的灵敏度。

 

上一篇:获得实验室高质量RNA常见分离方式简述 下一篇:细胞如何适应无血清培养基解答