在ELISA试剂盒中一般有两次抗原抗体反响，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反响的完结需求有必定的温度和时刻，这一保温进程称为温育(incubation)，有人称之为孵育，在ELISA中似不恰当。
一、温育时刻:
ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发作。以抗体包被的夹心法为例，参加板孔中的标本，其间的抗原并不是都有平等的和固相抗结合的时机，只需zui靠近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐渐平衡的进程，因而需经扩散才干到达反响的结尾。在这以后参加的酶符号抗体与固相抗原的结合也相同如此。这就是为什么ELISA反响总是需求必定时刻的温育。
二、ELISA试剂盒温育温度：
温育常选用的温度有43℃、37℃、室温文4℃(冰箱温度)等。37℃是试验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的适宜温度。在树立ELISA办法作反响动力学研讨时，试验标明，两次抗原抗体反响一般在37℃经1-2小时，产物的生成可达顶峰。为加速反响，可进步反响的温度，有些试验在43℃进行，但不宜选用更高的温度。抗原抗体反响4℃更为完全，在放射免疫测定中多使反响在冰箱中过夜，以构成zui多的沉积。但因所需时刻太长，在ELISA中一般不予选用。
三、温育保温：
保温的方法除有的ELISA仪附有特制的电热块外，一般均选用水浴，可将ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底应贴着水面，使温度敏捷平衡。为防止蒸腾，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此刻可让反响板漂浮在水面上。若用保温箱，ELISA板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性杰出的资料如金属等，在盒底垫湿的纱布，最终将ELISA板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱中预温至规则的温度，特别是在气温较低的时分更应如此。无论是水浴仍是湿盒温育，反响板均不宜叠放，以确保各板的温度都能敏捷平衡。室温温育的反响，操作时的室温应严厉约束在规则的范围内，规范室温温度是指20-25℃，但具体操作时可根据说明书的要求操控温育。室温温育时，ELISA板只需平置于操作台上即可。
实际测定操作注意事项：
1、不同的温育环境对检测结果有影响，操作中应严格按照说明书控制温育时间及温度，并注意封闭避免边缘效应。
2、为确保各板温度都能迅速达到平衡，不可将反应板叠加放置，设定的温度及时间严格按照说明书进行，一般加入待测标本后使其与固相抗原(抗体)置于37℃环境下温育。因为很多恒温箱的构造，温度及检测的温度并非酶标板温育温度，所以使用恒温箱温育时建议将温度计置于酶标板旁，保证酶标板旁温度为37℃。
3、干育和水温的影响差异较为明显，建议使用水温，注意将固相板放入水中，防止受热不均匀。
4、试剂盒一般设定的反响温度为 37℃，在这个温度下放置 30 分钟，蒸腾的水分会许多，对于全部反响体系来讲，各种反响物的浓度会不断添加，这么必会致使反响毕竟的值添加，温育时贴封片或加盖，避免标本或稀释液蒸发，吸附于孔壁。
5、试剂盒断定的一定温度下的反响时间并不是反响的完毕，添加反响的温度，会加速反响，一样添加时间会延伸反响，这么得到的反响程度会比试剂盒断定的反响程度多，也会引起阴性高值或假阳性。
6、实验操作的严谨性与实验操作规范密不可分，未使用的试剂应储存于2-8℃，使用时应回温到室温（20-25℃）。切忌不同批次的试剂混合使用，要经常检查酶标仪和微量移液器的精度和准备度…… ELISA看起来很简单，但是在实际操作过程中，绝不能掉以轻心，除了严谨规范的实验操作，高品质的试剂盒与专业的技术团队也是获得准确结果的保证！
