线粒体-3-磷酸甘油脱氢酶（mt-GPD）活性测定试剂盒说明书
一、产品简介：
线粒体-3-磷酸甘油脱氢酶（mt-GPD）存在于线粒体中，在 3-磷酸甘油途径中起重要作用，催化底物 3-磷酸甘油生成磷酸二羟丙酮，同时生成的电子和氢进入呼吸链参与氧化磷酸化；在电子传递体（PMS）存在下，使噻唑蓝（MTT）还原生成蓝色产物，通过检测该蓝色产物在 550nm 处的增加速率，即可得出 mt-GPD 活性大小。
二、试剂盒组成和配制：
三、所需的仪器和用品：
酶标仪、96 孔板、可调试移液器、台式离心机、水浴锅、研钵、冰和蒸馏水。四、线粒体-3-磷酸甘油脱氢酶（mtGPD）活性测定：建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！
1、线粒体制备（提示：整个线粒体的提取过程须保持 4℃低温环境）：
① 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细菌/细胞，加入 1mL 试剂一，用冰浴匀浆器或研钵匀浆，转移至离心管后于 4℃×700g 离心 10min。
② 弃沉淀，上清液移至另一离心管中，4℃×12000g 离心 10min。用移液器移除上清液(上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的酶活性（此步可选做）)，留下沉淀（沉淀即为线粒体）。
③ 在沉淀（线粒体）中加入200μL试剂二和2μL试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10秒，重复30次），液体置于冰上用于线粒体-3-磷酸甘油脱氢酶（mtGPD）活性测定。【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取，或按照细菌/细胞数量（10
4）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。
2、上机检测：
① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 550nm。
② 所有试剂解冻至室温（25℃），在 96 孔板中依次加入下列试剂：
【注】：加完试剂七即启动反应，所以试剂七加完需立即检测，若ΔA 小于 0.05，则增加样本上样量 V1，试剂六相应减少保持原体系不变（如样本上样量为40μL 时，试剂六为 130μL）。则改变后的 V1 需带入计算公式重新计算。
五、结果计算：
1、 按样本蛋白浓度计算：
酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟还原 1 nmol 噻唑蓝（MTT）定义为一个酶活性单位。mtGPD 活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×10
9]÷(V1×Cpr) ÷T=493.8×ΔA÷Cpr
2、 按样本鲜重计算：
酶活定义：每克组织每分钟还原 1 nmol 噻唑蓝（MTT）定义为一个酶活性单位。mtGPD 活性(nmol/min/g 鲜重[ΔA×V2÷(ε×d)×10
9]÷(W×V1÷V)÷T=99.8×ΔA÷W
3、 按细菌或细胞密度计算：
酶活定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟还原 1 nmol 噻唑蓝（MTT）定为一个酶活单位。mtGPD 活性(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V2÷(ε×d)×10
9]÷(500×V1÷V)÷T=0.2×ΔA
ε---还原型 MTT 的摩尔消光系数，8.1×10
3 L/mol/cm；
d---96 孔板光径，0.5cm；
V---加入提取液体积，0.202mL；
V1---加入样本体积，0.02 mL；
V2---反应体系总体积，2×10
-4 L；
T---反应时间，5min；
W---样本质量，g；
500---细菌或细胞总数，500 万；
Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。
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