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酪氨酸酶活性检测试剂盒

P128750
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注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。
货号:P128750
规格:50T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系工作人员

溶液的配制:
1、 试剂一:临用前每瓶加入 16 mL 提取液充分溶解待用,现配现用。溶解后易氧化,24h 要尽快用完。
产品说明:
酪氨酸酶(tyrosinase:EC1.14.18.1)是一种单酚单加氧酶,是具有双功能的含铜糖蛋白,广泛存在于植物、
酵母和动物组织中。酪氨酸酶是生物体合成黑色素的关键酶,也是引起果蔬酶促褐变的主要因素,同时也对昆虫
的免疫及生长有重要影响
酪氨酸酶催化L-多巴生成多巴色素,其在475nm下有特征吸收峰,进而测定出酪氨酸酶的活性。

注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者
增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、细胞超声破碎仪、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研
钵/匀浆器、冰、蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、组织:称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。12000g,4℃离心 20min,取上清,置冰上待测。
2、细胞或细菌样本的制备:先收集细胞或细菌样本到离心管内,弃上清,按照每 500 万细胞或细菌加入 1mL
提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率 200w,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次)。12000g,4℃离心 20min,取上清,
置冰上待测。
3、血清(浆):直接检测。若有浑浊则离心后取上清使用。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热30min,波长调至475nm。蒸馏水调零。
2、 加样表(在1mL玻璃比色皿中分别加入)

将上述试剂分别加入比色皿后迅速吹打混匀,记录第 10s 的吸光值 A1,迅速置于 37℃(哺乳动物)或 25℃
(其他物种)水浴或培养箱中 3min,拿出迅速擦干测定 3min10s 时的吸光值 A2,计算 ΔA =A2 -A1。
三、酪氨酸酶酶活计算
1、按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化生成1nmol多巴色素的酶量定义为一个酶活性单位。
酪氨酸酶(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V反总×109÷(V样×Cpr)÷T=90.09×ΔA÷Cpr
2、按样本质量计算:
单位的定义:每g组织每分钟催化生成1nmol多巴色素的酶量定义为一个酶活性单位。
酪氨酸酶(U/g 质量)=ΔA÷(ε×d)×V反总×109÷(W÷V提取×V样)÷T=90.09×ΔA÷W
3、按细胞或细菌数量计算:
单位的定义:每104个细胞或细菌每分钟催化生成1nmol多巴色素的酶量定义为一个酶活性单位。
酪氨酸酶(U/104 cell)=ΔA÷(ε×d)×V反总×109÷(500÷V提取×V样)÷T=0.18×ΔA
4、按血清(浆)体积计算:
单位的定义:每mL血清(浆)每分钟催化生成1nmol多巴色素的酶量定义为一个酶活性单位。
酪氨酸酶(U/mL)=ΔA÷(ε×d)×V反总×109÷V样÷T=90.09×ΔA
V反总:反应总体积,10-3L;ε:多巴色素的摩尔消光系数:3.7×104L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;109:
单位换算系数,1mol=109nmol;V样:加入的样本体积,0.1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g;
V提取:提取液体积,1mL;500:细胞或细菌总数,500万;T:反应时间,3min。
注意事项:
1. 当ΔA大于0.3时,建议将样本用提取液稀释后测量;ΔA过小时,建议增加酶促反应时间(5min或10min)或增
加加入的样本体积来测定。计算时注意同步修改计算公式。
实验实例:
1、 取 0.1g 稗 草 叶 加 入 1mL 提 取 液 进 行 匀 浆 研 磨 , 取 上 清 后 按 照 测 定 步 骤 操 作 , 测 得 计 算
ΔA=A2-A1=0.105-0.054=0.051,按样本质量计算酶活得:
酪氨酸酶(U/g 质量)=90.09×ΔA÷W=90.09×0.051÷0.1=45.95U/g 质量。
2、 取 0.1g 土豆加入 1mL 提取液进行匀浆研磨,取上清稀释 4 倍后按照测定步骤操作,测得计算
ΔA=A2-A1=0.200-0.047=0.153,按样本质量计算酶活得:
酪氨酸酶(U/g 质量)=90.09×ΔA÷W×F(稀释倍数)=90.09×0.153÷0.1×4=551.35U/g 质量。
3、 取兔血清后按照测定步骤操作,测得计算 ΔA=A2-A1=0.388-0.328=0.06,按样本体积计算酶活得:
酪氨酸酶(U/mL)=90.09×ΔA=90.09×0.06=5.4 U/mL。

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