T4 DNA Ligase

产品编号： P-PR1232

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P-PR1232-500U×10	盒	500U×10	¥4680.00	登录查看

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商品属性：

产品名称	规格	货号
T4 DNA Ligase	500U×10	P-PR1232

浓度： 5U/μl
产品概述：
在有 Mg2+和 ATP 存在的条件下，T4 DNA Ligase 能催化双链 DNA 或 RNA 上相邻的 5´-磷酸末端和 3´-羟基末端形成磷酸二酯
键。该酶不仅能够催化双链 DNA 的平末端或粘性末端之间的连接，还可以修复双链 DNA、RNA 或 DNA/RNA 杂交双链中的单
链切刻，但不能催化单链 DNA 之间的连接。
保存条件：-20℃保存。
酶储存缓冲液：
10 mM Tris-HCl (pH 7.5) ，50mM KCl，1mM DTT， 0.1mM EDTA，50% (v/v) glycerol。
5 × T4 DNA Ligase Buffer250 mMTris-HCl (pH 7.5)， 50mM MgCl2，50mM DTT， 5mM ATP，连接促进剂。
来源：纯化于携带T4 DNA ligase 基因的E. coli 菌株。
抑制剂和热失活：大于200mM的NaCl或KCl可以强烈抑制连接酶活性。65℃加热 10分钟或70℃加热5分钟即可失活。
单位定义：
在37℃，20分钟内交换1 nmole 的32PPi所需要的酶量定义为一个Weiss单位。本产品酶1U(Weiss Unit)相当于200个粘性末端单
位。在T4 DNA 连接酶反应缓冲液中，16℃条件下，30分钟能够使50%的经Hind III消化的λDNA 片段连接所需要的酶量为一个粘性末端单位。
质量控制：
蓝白斑分析实验表明白斑数小于2%;过量T4 DNA Ligase 混合超螺旋质粒检测实验表明无核酸酶检出；SDS-PAGE检测重组蛋
白纯度大于99%。
应用：双链DNA粘性末端和平末端的连接；TA克隆；双链DNA的切刻修复等。
连接反应体系：

1.在一个无菌0.2ml的PCR管中加入以下成分

用手指轻弹管底混匀各成分，离心数秒使反应混合物沉到管底。
2.反应条件
粘性末端连接：25℃反应5-10分钟。
平末端连接或者一个平端另一个为粘端的连接：25℃反应30-60分钟。
3.连接载体和片段的使用量
连接载体和片段的量一般按照摩尔比 1:3-1:10 进行，片段使用量比载体使用量大，载体和片段的使用量一般为 50-100ng 之间。
例如，3kb 的载体和 0.5kb 片段按摩尔比 1:3 的连接反应。假如使用 50ng 的 3kb 载体，那么 0.5kb 的片段需要量计算方法为：
[（50ng×0.5kb）÷3kb]×(3÷1)=25ng
4.转化
连接完成后，取 5-10μl 连接产物加到合适的感受态细胞中，按照感受态细胞说明书中所叙述的转化步骤进行转化。连接反应结
束后不能转化时，可将连接产物置于-20℃冰箱中保存。
注意事项：
1. 化冻 5×T4 DNA Ligase Buffer 后，需要混匀后再使用。
2. T4 DNA Ligase 最适活性温度为 37℃，但是高温连接形成的连接产物的转化效率会大大降低，所以选用 25℃或 16℃等稍低的连接温度。如果连接产物不用转化且需要高的连接效果，可以在 37℃条件下进行。
3.该酶需要 Mg2+为激活剂，因此螯合 Mg2+的 EDTA 的存在会阻碍连接反应。溶解于高浓度 EDTA 缓冲液的 DNA 需要用灭菌水或TE 缓冲液进行置换。

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