pUC57simpleEVL Seamless 试剂盒

产品编号： P-PR1223

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pUC57simpleEVL Seamless 试剂盒

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P-PR1223

保存条件：-20℃保存
产品介绍：
区别于拓扑克隆、TA 载体克隆和酶切克隆等常规克隆方法，无缝克隆技术可在重组酶的作用下，只需一步反应，便可将片段克隆到任何载体中的任意位置，得到重组质粒。无缝克隆技术作为一种非常强大的克隆技术，具有快速、简便、高效、多片段组装和定向克隆等特点，用于单个 DNA 片段的克隆，多个 DNA 片段组装克隆以及多位点突变构建等实验目的。
产品特点：
1.简单、快速、精确、定向克隆，连接过程只需要 15 分钟。
2.只需要简单的 PCR 扩增就可以制备片段和载体 DNA，不需要内切酶、连接酶和磷酸化酶。
3.可以克隆长片段 DNA。
4.pUC57-simpleEVL 线性化载体，经特殊处理，零背景。
操作步骤：
1.pUC57-simpleEVL 使用方法：
（1）pUC5-simpleEVL当做克隆载体使用，只需要在扩增PCR产物的上游引物5’ 端添加序列 CTTCGCGAATGCGTCGAGAT ，在下游引物 5’ 端添加序列
CGTCGGTCCCGGCATCCGAT，就可以通过无缝连接到pUC57-simpleEVL中。
（2）测序引物
M13F(-47)：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
M13R(-48)：GAGCGGATAACAATTTCACACAGG
(3)pUC57-simpleEVL 载体为 EcoRV 酶切后的线性化载体 pUC57-simpleEVL。

2. 载体片段的重组连接

（1）在一个 0.2ml PCR 管中依次加入

（2）操作：轻轻混合，离心数秒。在 PCR 仪上 50℃保温 15 分钟。反应结束后，将离心管置于冰上，等待细菌转化。如暂时不转化细菌，可冻存于-20℃。
注意：
1.载体用量一般在50-100ng较好。载体和片段的摩尔比为1:1至1:3。片段小于200bp时，片段用量可增加到载体的5倍量。
2.50℃反应时间不要超过60分钟。
3.转化
（1）取2-4l连接产物加到刚刚化冻的感受态细胞中，轻轻混匀，冰水浴20-30分钟。
（2）42℃水浴热击90秒钟，切勿晃动水面。热击结束后立即置于冰水浴中保持2分钟。
（3）往管中加500l的SOC或LB培养基，放入37℃摇床中200rpm左右培养60分钟。
（4）4000rpm离心1分钟，弃掉部分上清，保留100-200l，用吸头轻轻吹打菌块重悬细菌，取一半菌液涂布于含抗生素的LB固体培养平板上，待液体吸干后，倒置平板，37℃培养过夜。
4.阳性克隆鉴定：
（1）菌落PCR方法；
（2）限制性酶切分析方法；
（3）DNA测序分析方法。

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