公司产品仅供科研研究使用、不得用于临床诊断！
商品属性：
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产品名称 |
规格 |
货号 |
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pBM30 Toposmart Cloning Kit（TOPO克隆载体 原核表达） |
20 次 |
P-PR1209 |
保存条件：-20℃保存
产品介绍：
（5）产物要求：为保证 PCR 产物完整，建议 72℃后延伸 5-10 分钟。连接前使用琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物的质量和纯度，如 PCR 产物为非单一性条带，目的片段一定要切胶回收。如 PCR 产物为单一条带，无引物二聚体，可取 1-3l 的 PCR 产物直接连接。但若扩增模板为质粒 DNA，应注意质粒的抗性。由于 pBM40 载体为卡那抗性，以氨苄抗性的模板质粒扩增的 PCR 产物直接连接后的产物可涂布在卡那抗性的 LB 平板上。以卡那抗性的模板质粒扩增的 PCR 产物应切胶回收后再连接。
（6） 片段用量：胶回收的 DNA 片段一般使用量为 50-100ng。对照片段为 5’端带CACC四个碱基的全长 EGFP 基因的平末端产物，表达产物大小为 32.6kD。
（7） 往 T7 和 T7t 引物干粉管加 100l 灭菌水即为 5M 浓度的引物。
操作步骤：
1.连接反应
按下表，在一个 0.2ml PCR 管中依次加入
加完试剂后，轻轻混匀低速离心，使溶液集中在管 底。PCR 仪控温 25℃反应 15 分钟，反应结束后， 将离心管置于冰上，等待细菌转化。如暂时不转化， 可冻存于-20℃。
2. 转化
（1）取 5µl 连接产物到 100µl 刚刚融化的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴 20-30 分钟。
（2）42℃水浴中热击 30 秒钟。
（3）立刻置于冰水浴中 2 分钟。
（4）加入 900µl 无菌的不含抗生素的 SOC 或 LB，37℃，200rpm 振荡培养 60 分钟。
（5）4000rpm 离心 1 分钟，去掉部分上清，保留 100µl 用移液器轻吹菌体，充分悬浮菌液，取全部菌液涂布，然后 37℃培养过夜（12-16 小时）。
3. 阳性克隆鉴定：
（1）菌落PCR方法鉴定阳性克隆
A.用10l吸头挑选克隆至预先加有10μl无菌水或LB培养基的PCR管中，吹打混合。
B.在25 l PCR反应体系中加入2μl细菌悬液为模板、5μM浓度的CMVPfor和SV40PolyArev各1μl，PCR方法鉴定阳性克隆。B.在25l PCR反应体系中加入2μl细菌悬液为模板、T7和T7t各1μl，PCR方法鉴定阳性克隆。
C.PCR扩增条件：94℃预变性5分钟（裂解细胞，失活核酸酶），94℃变性10 秒钟，55℃退火10秒钟（注：使用基因特异性引物做PCR鉴定时，退火温度则需按其最适温度进行调整），72℃延伸（ 根据片段的大小决定延伸时间，通常每1-2分/1kb），30-35个循环，72℃后延伸5分钟。1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，有强烈的明显条带的克隆为重组体，与插入片段大小相近（由于扩增引物在克隆位置的两侧，所以PCR扩增出的DNA的长度比插入片段大349bp）可视为阳性克隆。菌落PCR方法鉴定重组体时一定要设立一个不加菌液的阴性对照。
（2） 限制性酶切分析阳性克隆
pBM30为低拷贝质粒。挑取单菌落接种于8mL含卡那的LB培养液中，过夜培养，小量制备质粒，参考pBM30图谱，选择合适的限制性内切酶（NdeI，Bgl II，Kpn I，NcoI，Xho I），酶切后电泳鉴定重组质粒。
（3） 测序：用T7和T7t对质粒进行测序分析。
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