甘油（Glycerol）含量

注    意：正式测定前务必取 3 - 5 个预期差异较大的样本做预测定

产品简介：

甘油储存于脂肪细胞中是甘油三酯代谢的最终产物之一。在生产、生活中甘油可用作溶剂，润滑剂，药剂和甜味剂。

甘油被甘油激酶(GK)的催化生成甘油-1-磷酸(G-1-P)。G-1-P 被甘油磷酸氧化酶(GPO) 氧化生成过氧化氢(H2O2)，H2O2 与 4-氨基氨替吡啉等反应生成红色醌类化合物，其在510nm 处有特征吸收峰，通过检测 510nm 处吸光值即可得出甘油含量。 

所需的仪器和用品：

酶标仪、96 孔板、可调式移液器、离心机、研钵、匀浆器、蒸馏水。

试剂盒的组分与配制：

2、上机检测：

① 酶标仪预热 30min，调节波长到 510 nm。

② 试剂一的制备：

1. 开盖前用力甩几下使粉剂落入底部；

2. 准备 4.2mL 预冷过的蒸馏水；

3. 向试剂一中加入1mL 蒸馏水，震荡混匀（使粉剂悬浮在液体中即可）；

4. 将液体转移至匀浆器中充分匀浆；

5. 匀浆后转移到瓶中；

6. 步骤 3 – 5 重复操作多次（用于冲洗试剂一与匀浆器中残留）；

7. 充分震荡混匀后使用。

（注意：1. 试剂一现用现配，放置后容易凝聚蛋白絮状物；2. 加入试剂一的蒸馏水总体积为 4.2mL；3. 一定要多次冲洗试剂一与匀浆器（步骤6）以控制损耗；）

③ 其他试剂解冻至室温（25℃）。

④ 在 96 孔板中依次加入：

【注】

1. 若测定管的 A 值小于 0.05，则需增加上样量 V1（如增至 40μL，则试剂二相应减小），样本量 V1 需代入计算公式重新计算。若测定管的 A 值大于 1，则需将样本进行稀释（用提取液稀释）或减少样本加样量 V1（如减至 5μL，则试剂二相应增加），稀释倍数D 或样本量 V1 需代入计算公式重新计算。 

2. 若样本自身含有高的背景值或者含有高的抗氧化物质（如 VC 等），需要增设一个样本自身对照（即 10μL+100μL试剂二+60μL 试剂三，避光反应 30min，510nm 读取吸光值 A），测定管减去对照管，代入计算公式计算。

 试剂一溶解后不建议保存，如果保存请 -20℃ 冷冻，再次使用时可能会有蛋白絮状物，使用移液器反复吹打混匀 取上清使用。

甘油含量测定：

1、样本制备：

① 组织样本：

称取约 0.1g 组织样本加入研钵中，加入 1mL 提取液，在冰上进行匀浆，12000rpm，4℃或室温离心 10min，取上清液待测。

【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液(mL)为 1：5~10 的比例进行提取。

② 细菌/细胞样本：

先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细胞加入 1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；12000rpm 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（10⁴）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。

③ 液体样本：澄清的液体样本直接测定，若浑浊则离心后取上清检测。

结果计算：

1、按样本质量计算：

甘油（μmol/g 重量）=(C 标准×V2) ×(A 测定-A 空白)÷(A 标准-A 空白)÷(W×V1÷V) ×D

=0.8×(A 测定-A 空白)÷(A 标准-A 空白) ÷W×D

甘油（μg/g 重量）=(C 标准×V2) ×(A 测定-A 空白)÷(A 标准-A 空白)÷(W×V1÷V) ×D

=73.672×(A 测定-A 空白)÷(A 标准-A 空白) ÷W×D

2、按细胞数量计算：

甘油（μmol/10⁴ cell）=(C 标准×V2) ×(A 测定-A 空白)÷(A 标准-A 空白)÷(500×V1÷V) ×D

=0.8×(A 测定-A 空白)÷(A 标准-A 空白) ÷500×D 

甘油（μg/10⁴ cell）=(C 标准×V2) ×(A 测定-A 空白)÷(A 标准-A 空白)÷(500×V1÷V) ×D

=73.672×(A 测定-A 空白)÷(A 标准-A 空白) ÷500×D

3、液体中甘油含量计算：

甘油（mmol/L）=(C 标准×V2) ×(A 测定-A 空白)÷(A 标准-A 空白)÷V1×D

=0.8×(A 测定-A 空白)÷(A 标准-A 空白) ×D

甘油（μg/mL）=(C 标准×V2) ×(A 测定-A 空白)÷(A 标准-A 空白)÷V1×D

=73.672×(A 测定-A 空白)÷(A 标准-A 空白) ×D

C 标准---0.8mmol/L=0.8μmol/mL=73.672μg/mL； V---提取液体积，1mL；

V1---样本加入体积，0.01mL； V2---标准品加入体积，0.01mL；

500---细胞数量，百万； D---稀释倍数,未稀释即为 1；

W---样本取样质量，g。