花青素还原酶（anthocyanidin reductase，ANR）试剂盒说明书
微量法100T/96S
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
花青素还原酶是黄酮合成途径中的关键酶，在植物体内起非常重要的调控作用，对花青素还原酶的调控机制研究有利于从基因水平改变植物的品质。
测定原理：
花青素还原酶在NADPH存在的条件下作用于飞燕草色素转变为表没食子儿茶素和NADP，使反应体系在340nm处的吸光值下降，吸光值下降速率反应了花青素还原酶的活性。
自备仪器和用品：
天平、研钵、低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、蒸馏水。
试剂组成和配制
提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体20mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加1mL蒸馏水溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂三：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加1mL蒸馏水溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂四：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加1mL蒸馏水溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
酶液提取
1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。10000g ，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2. 培养液等液体：直接检测。
测定操作表
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试剂名称
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测定管
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试剂一（μL）
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150
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试剂二（μL）
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10
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酶液（μL）
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20
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试剂三（μL）
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10
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试剂四（μL）
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10
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充分混匀，于微量石英比色皿/96孔板测定340处吸光值A1，然后在40℃温育20min后，再测定340nm处吸光值A2，△A=A1-A2
花青素还原酶（anthocyanidin reductase，ANR）试剂盒说明书酶活性计算公式
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1）按照蛋白浓度计算
酶活性定义：在40℃，pH6.5条件下，每毫克蛋白每分钟催化1nmolNADPH定义为一个酶活力单位。
ANR活性（nmol/min/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×V反总÷(V样×Cpr) ÷T
= 80.39×ΔA÷Cpr
（2）按照样本质量计算
酶活性定义：在40℃，pH6.5条件下，每克组织每分钟催化1nmolNADPH定义为一个酶活力单位。
ANR活性（nmol/min/g 鲜重）= ΔA÷（ε×d）×V反总÷(W ×V样÷V样总) ÷T
= 80.39×ΔA÷W
（3）按液体体积计算
酶活性定义：在40℃，pH6.5条件下，每毫升液体每分钟催化1nmolNADPH定义为一个酶活力单位。
ANR活性（nmol/min/mL）= ΔA÷（ε×d）×V反总÷V样÷T
= 80.39×ΔA
V反总：反应体系总体积，0.2mL；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，20min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g
b. 用96孔板测定的计算公式如下
（1）按照蛋白浓度计算
酶活性定义：在40℃，pH6.5条件下，每毫克蛋白每分钟催化1nmolNADPH定义为一个酶活力单位。
ANR活性（nmol/min/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×V反总÷(V样×Cpr) ÷T
= 160.78×ΔA÷Cpr
（2）按照样本质量计算
酶活性定义：在40℃，pH6.5条件下，每克组织每分钟催化1nmolNADPH定义为一个酶活力单位。
ANR活性（nmol/min/g 鲜重）= ΔA÷（ε×d）×V反总÷(W ×V样÷V样总) ÷T
= 160.78×ΔA÷W
（3）按液体体积计算
酶活性定义：在40℃，pH6.5条件下，每毫升液体每分钟催化1nmolNADPH定义为一个酶活力单位。
ANR活性（nmol/min/mL）= ΔA÷（ε×d）×V反总÷V样÷T
= 160.78×ΔA
V反总：反应体系总体积，0.2mL；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，20min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g
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