H2S含量测定试剂盒说明书
微量法100T/96S
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
H2S是一种新型气态信号分子，存在于脑内的神经递质，生理浓度的H2S对神经系统海马的长时程增强功能具有重要的调节作用，并对自发性高血压、出血性休克及肝硬化等疾病的过程发挥着重要的病理生理效应。
测定原理：
H2S与醋酸锌、N, N-二甲基对苯二胺和硫酸铁铵等反应生成亚甲基蓝，亚甲基蓝在665nm处有最大吸收峰，通过测定其吸光值可计算H2S含量。
自备仪器和样品：
天平、低温离心机、酶标仪、96孔板、蒸馏水。
试剂组成和配制：
提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体25mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体16mL×1瓶，4℃保存。
试剂三：液体8mL×1瓶，4℃避光保存。
试剂四：液体8mL×1瓶，4℃保存。
试剂五：液体1.5mL×1管，4℃避光保存。
样品处理：
1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
3. 血清（浆）：直接测定。
操作表：
1、 酶标仪预热30min，调节波长至665nm。
2、 操作表
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空白管
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测定管
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样品（μL）
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150
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H2O（μL）
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150
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试剂一（μL）
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150
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150
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充分震荡混匀
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试剂二（μL）
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150
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150
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10000g，4℃，离心10min，去上清，留沉淀
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H2O（μL）
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150
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150
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10000g，4℃，离心10min，去上清，留沉淀
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试剂一（μL）
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75
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75
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试剂三（μL）
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75
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75
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充分震荡混匀
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试剂四（μL）
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75
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75
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10000rpm，4℃，离心10min，吸取200μL上清于96孔板中
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试剂五（μL）
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10
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10
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混匀，25℃静置5min，测定665nm吸光值，记为A测定和A空白，ΔA=A测定-A空白。
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H2S含量测定试剂盒说明书计算公式：
用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线回归方程为：y = 0.0022x，R2 = 0.9988
（1）组织样品
a.按照蛋白浓度计算
H2S（nmol/mg prot）=×V反总÷(V样×Cpr)=681.8×ΔA÷Cpr
b.按照样本重量计算
H2S（nmol/g 鲜重）=×V反总÷(V样÷V样总×W)= 681.8×ΔA÷W
(3) 细胞
H2S（nmol/104 cell）=×V反总÷（V样÷V样总×细胞数量(万个)）=681.8×ΔA÷细胞数量（万个）
（2）液体样品H2S（nmol/mL）=×V反总÷V样= 681.8×ΔA
V反总：反应总体积，0.225mL；V样：反应中样品体积，0.15mL；V样总：加入提取液体积，1mL；W：样品质量，g；Cpr：蛋白浓度，mg/mL
注意事项
最低检出限为1nmol/mL。
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