内切β1，4葡聚糖酶（Cx）检测试剂盒

内切-β-1，4-葡聚糖酶（Cx）活性测定试剂盒说明书

                                          微量法 100管/48样

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义： 

Cx（EC3.2.1.4）存在于细菌、真菌和动物体内，是纤维素酶系的组份之一，Cx主要作用于非晶态纤维素和水溶性纤维素衍生物，随机水解糖苷键，将其分解成葡萄糖、纤维二糖、纤维三糖和其他寡聚体。

测定原理：

采用3,5－二硝基水杨酸法测定Cx催化羧甲基纤维素钠降解产生的还原糖的含量。

自备仪器和样品：

酶标仪/可见分光光度计、水浴锅、离心机、可调式移液器、96孔板/微量石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体6mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：液体25mL×1瓶，4℃保存；

样品测定的准备： 

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。

2、加样表（在EP管中依次加入下列试剂）：

混匀，37℃准确水浴2h

内切-β-1，4-葡聚糖酶（Cx）活性测定试剂盒说明书混匀， 90℃水浴10min（盖紧，防止水分散失），冷却后，取200μL至微量石英比色皿或96孔板中，测540nm下吸光值A，计算ΔA=A测定管-A对照管。每个测定管需设一个对照管。

Cx活性计算

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、标准条件下测定回归方程为y = 6.4078x - 0.0673；x为标准品浓度（mg/mL），y为吸光值。

2、血清（浆）Cx活力的计算

单位的定义：每mL血清（浆）每分钟催化产生1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。

Cx活力(μg /min/mL)= [1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反总]÷V样÷T

=14.305×(ΔA+0.0673)

3、细胞、细菌和组织中Cx活力的计算

（1）按照蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。

Cx活力(μg /min/mg prot)=[ [1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反总]÷(V样×Cpr) ÷T

=14.305×(ΔA+0.0673) ÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟催化产生1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。

Cx活力(μg /min /g鲜重)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反总]÷(W× V样÷V样总) ÷T

=14.305×(ΔA+0.0673) ÷W

（3）按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。

Cx活力(μg /min /10⁴ cell)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反总]÷(500×V样÷V样总) ÷T

=0.0286×(ΔA+0.0673)

1000：1mg/mL=1000ug/mL；V反总：反应体系总体积，0.11mL； V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，120 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

b.用96孔板测定的计算公式如下

1、标准条件下测定回归方程为y = 3.2039x - 0.0673；x为标准品浓度（mg/mL），y为吸光值。

2、血清（浆）Cx活力的计算

单位的定义：每mL血清（浆）每分钟催化产生1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。

Cx活力(μg /min/mL)= [1000×(ΔA+0.0673) ÷3.2039×V反总]÷V样÷T

=28.61×(ΔA+0.0673)

3、细胞、细菌和组织中Cx活力的计算

（1）按照蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。

Cx活力(μg /min/mg prot)=[ [1000×(ΔA+0.0673) ÷3.2039×V反总]÷(V样×Cpr) ÷T

=28.61×(ΔA+0.0673) ÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟催化产生1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。

Cx活力(μg /min /g鲜重)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷3.2039×V反总]÷(W× V样÷V样总) ÷T

=28.61×(ΔA+0.0673) ÷W

（3）按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。

Cx活力(μg /min /10⁴ cell)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷3.2039×V反总]÷(500×V样÷V样总) ÷T

=0.057×(ΔA+0.0673)

1000：1mg/mL=1000ug/mL；V反总：反应体系总体积，0.11mL； V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，120 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。