胃蛋白酶(Pepsin)试剂盒说明书
微量法 100T/48S
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
胃蛋白酶由胃粘膜主细胞分泌,分解食物中蛋白质成小肽段。一般用于神经性低酸症的鉴别,慢性胃炎、慢性胃扩张、慢性十二指肠炎等症状时也会引起胃蛋白酶分泌的减少。
测定原理:
胃蛋白酶可催化血红蛋白水解,水解产物与福林试剂反应后显蓝色;一定范围内,其颜色的深浅与胃蛋白酶活性呈正比。
自备仪器和样品:
可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制:
试剂一:液体100mL×1瓶,4℃保存。
试剂二:液体20mL×1瓶,4℃保存。
试剂三:粉剂×1瓶,4℃避光保存。临用前加入10mL试剂二充分溶解。
试剂四:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加入10mL蒸馏水充分溶解。
试剂五:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加入15mL蒸馏水充分溶解。
试剂六:液体3.3mL×1瓶,4℃保存。
标准品:液体1.27mL×1支,0.5μmol/mL酪氨酸标准溶液浓度4℃保存。
粗酶液提取:
组织样品:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)冰浴匀浆,8000g,4℃离心10min,取上清,即粗酶液。
测定步骤:
1.分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长到580 nm,蒸馏水调零。
2. 试剂三和试剂四置于37℃水浴预热30min。
3. 标准管:取微量玻璃比色皿/96孔板,加入20μL标准品,40μL试剂二,120μL试剂五,20μL试剂六,混匀后室温静置20min,于580 nm测光吸收,记为A标准管。
4. 空白管:取微量玻璃比色皿/96孔板,加入20μL蒸馏水,40μL试剂二,120μL试剂五,20μL试剂六,混匀后室温静置20min,于 580 nm测光吸收,记为A标准空白管。
5. 对照管:取 EP管,加入100 μL蒸馏水,置于37℃水浴保温10min;加入100μL试剂四,盖紧后摇匀1min;加入20μL粗酶液,混匀后8000g 4℃离心10分钟取上清;在微量玻璃比色皿/96孔板加入上清液20μL,再加入40μL试剂二,120μL试剂五,20μL试剂六,混匀后室温静置20min,于580 nm测光吸收,记为A空白管。
6. 测定管:取 EP管,加入20μL粗酶液,100μL试剂三,置于37℃水浴保温10min;加入100μL试剂四,盖紧后摇匀1min;8000g 4℃离心10分钟取上清;在微量玻璃比色皿/96孔板加入上清液20μL,再加入40μL试剂二,120μL试剂五,20μL试剂六,混匀后室温静置20min,于 580 nm测光吸收,记为A测定管。
注意:空白管和标准管只需要测定一次。
计算公式:
a.使用微量玻璃比色皿测定的计算公式如下
(1)按蛋白浓度计算
活性单位定义:37℃每毫克蛋白每分钟催化血红蛋白水解生成1nmol酪氨酸为1个酶活单位。
胃蛋白酶(Pepsin)试剂盒说明书(nmol/min/mg prot)= C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×稀释倍数÷(Cpr×V1)÷T
=27500×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷Cpr
(2)按样本质量计算
活性单位定义:37℃每克组织每分钟催化血红蛋白水解生成1nmol酪氨酸为1个酶活单位。
胃蛋白酶活性(nmol/min/g 鲜重)= C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×稀释倍数÷(W×V1÷V2)÷T
=27500×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷W
C标准品:标准品浓度,0.5 μmol/mL酪氨酸;稀释倍数:(20+100+100)÷20=11;Cpr:粗酶液蛋白质浓度(mg/mL),需要另外测定;V1:加入反应体系中粗酶液体积(mL),20μL=2×10-2mL;W:组织质量(g);V2:粗酶液总体积(mL),1mL;T:催化反应时间(min),10min。
b.使用96孔板测定的计算公式如下
((1)按蛋白浓度计算
活性单位定义:37℃每毫克蛋白每分钟催化血红蛋白水解生成1nmol酪氨酸为1个酶活单位。
胃蛋白酶活性(nmol/min/mg prot)= C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×稀释倍数÷(Cpr×V1)÷T
=27500×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷Cpr
(2)按样本质量计算
活性单位定义:37℃每克组织每分钟催化血红蛋白水解生成1nmol酪氨酸为1个酶活单位。
胃蛋白酶活性(nmol/min/g 鲜重)= C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×稀释倍数÷(W×V1÷V2)÷T
=27500×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷W
C标准品:标准品浓度,0.5 μmol/mL酪氨酸;稀释倍数:(20+100+100)÷20=11;Cpr:粗酶液蛋白质浓度(mg/mL),需要另外测定;V1:加入反应体系中粗酶液体积(mL),20μL=2×10-2mL;W:组织质量(g);V2:粗酶液总体积(mL),1mL;T:催化反应时间(min),10min。
注意事项
试剂三、试剂四、试剂五临用前配制,配制好用不完的试剂4℃可保存一周。