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磷酸丙糖异构酶(TPI)检测试剂盒

BH-9611169
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磷酸丙糖异构酶(Triose-phosphate isomeraseTPI

试剂盒说明书

                                                     微量法100T/96S

注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

植物叶绿体中磷酸丙糖异构酶是光合作用中参与calvin循环的重要酶。作用于磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮之间的转化,磷酸二羟丙酮能快速透过叶绿体的包膜进入细胞质,并在其中逐步转化为蔗糖。

测定原理:

磷酸丙糖异构酶将磷酸二羟丙酮转化为3-磷酸甘油醛,3-磷酸甘油醛与NAD3-磷酸甘油醛脱氢酶的作用下生成3-磷酸甘油酸和NADH340nm处的吸光度变化反映了磷酸丙糖异构酶的活性的高低。

自备实验用品及仪器:

天平、低温离心机、研钵、震荡仪、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板

试剂组成和配制   

提取液一:液体100mL×1瓶,4℃保存。

提取液二:液体100mL×1瓶,4℃保存。

试剂一:液体12mL×1瓶,4℃保存。

试剂二:粉剂×1瓶,-20℃避光保存。临用前加2mL蒸馏水充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融

试剂三:粉剂×1瓶,-20℃避光保存。临用前加2 mL蒸馏水充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融

试剂四:粉剂×1瓶,-20℃避光保存。临用前加2 mL蒸馏水充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融

酶液提取

①总TPI提取:建议称取约0.1g样本,加入1mL提取液一,冰浴匀浆后超声破碎(冰浴,200W,破碎3s,间歇7s,总时间1min),然后4℃,8000g离心10min,取上清测定。

②胞浆和叶绿体TPI酶的分离:按照植物组织质量(g):提取液体积(mL)1510的比例(建议称取约0.1g样本,加入1mL提取液一),冰浴匀浆后于4℃,200g离心5min,弃沉淀,取上清在4℃,8000g离心10min取上清用于测定胞浆TPI酶活性,取沉淀加1mL提取液二,震荡溶解后超声破碎(冰浴,200W,破碎3s,间歇7s,总时间1min),然后4℃,8000g离心10min取上清测定叶绿体中TPI酶活性。

建议测定总TPI酶活性,按照步骤①提取粗酶液,若需要分别测定胞浆和叶绿体中的TPI,则按照步骤②提取粗酶液。

磷酸丙糖异构酶(Triose-phosphate isomeraseTPI

试剂盒说明书测定操作


1. 分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

2. 取微量石英比色皿/96孔板,依次加入120μL试剂一,20μL试剂二,20μL试剂三,20μL试剂四,20μL粗酶液,充分混匀,记录340nm10s的吸光值A1310s的吸光值A2,△A=A2-A1

计算公式

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义:每毫克组织蛋白每分钟生成1 nmolNADH定义为一个酶活力单位。

TPInmol/min/mg prot= ΔA÷ε×d×V反总÷(V×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

2按照样本质量计算

酶活单位定义:每组织每分钟生成1 nmolNADH定义为一个酶活力单位。

TPInmol/min/g 鲜重= ΔA÷ε×d×V反总÷(W ×V÷V样总) ÷T=321.54×ΔA÷W

V反总:反应体系总体积,0.2mLεNADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cmd:比色皿光径,1cmV样:加入样本体积,0.02mLV样总:加入提取液体积,1mLT:反应时间,5 minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样质量,g

b. 用96孔板测定的计算公式如下

1按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义:每毫克组织蛋白每分钟生成1 nmolNADH定义为一个酶活力单位。

TPInmol/min/mg prot= ΔA÷ε×d×V反总÷(V×Cpr) ÷T= 643.08×ΔA÷Cpr

2按照样本质量计算

酶活单位定义:每组织每分钟生成1 nmolNADH定义为一个酶活力单位。

TPInmol/min/g 鲜重= ΔA÷ε×d×V反总÷(W ×V÷V样总) ÷T= 643.08×ΔA÷W

V反总:反应体系总体积,0.2mLεNADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cmd:比色皿光径,0.5cmV样:加入样本体积,0.02mLV样总:加入提取液体积,1mLT:反应时间,5 minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样质量,g

 

 

 

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