线粒体柠檬酸(Mitochondrion citric acid, MCA)含量
试剂盒说明书
微量法 100管/96样
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
MCA是线粒体三羧酸循环的第一个中间产物,由柠檬酸合酶催化乙酰CoA与草酰乙酸合成,其含量是三羧酸循环强度的主要指标之一。
配合测定丙酮酸含量、丙酮酸脱氢酶活性、乙酰CoA含量、柠檬酸合酶活性和MCA含量,其中(1)丙酮酸含量和丙酮酸脱氢酶活性变化可以反映糖酵解进行程度,(2)综合分析丙酮酸含量、丙酮酸脱氢酶活性和乙酰CoA含量变化可以反映脂肪酸β-氧化途径提供的乙酰CoA情况,(3)乙酰CoA含量、柠檬酸合酶活性和MCA含量变化可以反映三羧酸循环进行状况。
测定原理:
MCA在柠檬酸裂解酶的作用下,生成α-酮酸(草酰乙酸);在弱酸性条件下,α-酮酸进一步与苯肼反应,生成相应的α-酮酸苯腙;α-酮酸苯腙在330nm处有吸收峰,该波长下吸光度的变化程度可反映出MCA的含量。
自备实验用品及仪器:
分光光度计/酶标仪、水浴锅、可调式移液枪、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、研钵、蒸馏水。
试剂组成和配制:
酸性提取液:液体100mL×1瓶,4℃保存。
碱性提取液:液体100mL×1瓶,4℃保存。
试剂一:液体6mL×1瓶,4℃保存。
试剂二:液体2mL×1瓶,4℃保存。
试剂三:粉剂×1瓶,4℃保存;临用前加入6mL蒸馏水充分溶解待用;用不完的试剂4℃保存;
标准液:液体1mL×1支,10μmol/mL柠檬酸标准液,4℃保存。
线粒体中柠檬酸提取:
称0.05~0.1g样品(建议称0.1g样本),加入0.5mL酸性提取液,冰上充分研磨,600g/min 4℃离心5min;取上清至另一EP管中,11000g/min 4℃离心10min,弃上清(取300μL该上清液和300μL碱性提取液中和后可用于细胞质CA含量测定);沉淀即线粒体,向沉淀中加入0.5mL酸性提取液,充分悬浮溶解,超声波破碎(功率20%,超声3秒,间隔10秒,重复30次),取此溶液300μL和300μL碱性提取液中和,混匀,置冰上待测(不可用于蛋白质含量测定)。
线粒体柠檬酸(Mitochondrion citric acid, MCA)含量
试剂盒说明书测定步骤:
1、分光光度计或酶标仪预热30 min以上,调节波长到330nm,蒸馏水调零。
2、试剂一、二和三37℃预热10min。
3、样本测定:
空白管和标准管只需要各做一个。
试剂名称(μL)
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空白管
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标准管
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测定管
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试剂一
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60
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60
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60
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蒸馏水
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60
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标准液
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60
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样本
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60
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试剂二
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20
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20
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20
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试剂三
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60
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60
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60
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充分混匀,330nm立即测定初始吸光值A1和37℃孵育30min后的吸光值A2,ΔA=A2 –A1。
柠檬酸含量计算:
(1)按蛋白浓度计算
柠檬酸含量(μmol/mg prot)=[C标准管×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ΔA标准管-ΔA空白管) ×V样]÷(V样÷Cpr)=10×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ΔA标准管-ΔA空白管)÷Cpr
蛋白质含量需要另外测定。
(2)按样本鲜重计算
柠檬酸含量(μ mol/g鲜重)=[C标准管×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ΔA标准管-ΔA空白管) ×V样]÷(W×V样÷V样总)=10×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ΔA标准管-ΔA空白管)÷W
C标准管:标准液浓度,10μmol/mL; V样:加入反应体系中样本体积:0.06mL;V样总:加入提取液体积:1mL;Cpr:样品蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g。
注意:最低检测限为10nmol/mg prot或1μmol/g鲜重。